由于細胞是生物學的基本單位，研究人員正更加努力地嘗試將它們進行單個分離、研究和比較。DNA研究主要涉及的是測序單細胞微生物相對簡單的基因組；而更大更復雜的人類細胞基因組則是一個更大的挑戰(zhàn)。隨著測序成本的大幅度下降，破譯來自單細胞的30億堿基的基因組并逐個細胞比較序列正在變?yōu)楝F(xiàn)實。
在過去的幾十年里，研究人員對于來自許多物種的成千上萬的基因進行了測序。幾乎在所有情況下，破譯的DNA都是從數(shù)百萬的細胞中提取出來并混合在一起。其結(jié)果是大量的數(shù)據(jù)，但是博德研究所的遺傳學家Joel Hirschhorn說：“當你看向的是整個細胞群時，有許多的現(xiàn)象其中包括大量細胞與細胞間的變異就會變得不再明顯。”這有可能會改變。
在會上，四個小組描述了關于基因組如何生成多樣性和什么導致特異腫瘤耐受治療的新見解——所有的都是來自單個人類細胞DNA測序的結(jié)果。他們的報告引發(fā)了科學家對單細胞測序潛力的興奮。“我們才剛剛開始觸及表面。”Hirschhorn說。
由于細胞是生物學的基本單位，研究人員正更加努力地嘗試將它們進行單個分離、研究和比較（Science, 7 January 2011, p.24）。DNA研究主要涉及的是測序單細胞微生物相對簡單的基因組；而更大更復雜的人類細胞基因組則是一個更大的挑戰(zhàn)。隨著測序成本的大幅度下降，破譯來自單細胞的30億堿基的基因組并逐個細胞比較序列正在變?yōu)楝F(xiàn)實。
對于艾伯特·愛因斯坦醫(yī)學院的統(tǒng)計遺傳學家Adam Auton而言，單細胞測序提供了一個了解重組（細胞分裂過程中配對染色體交換DNA片段的過程）的窗口。重組通過將各種版本的基因一起放置在新組合中幫助生成了遺傳多樣性。它也是細胞剔除異常DNA的一種方法。
研究人員長期以來一直在尋求一種途徑來測定發(fā)生在人類重組量，他們提出了一些間接的方式在家庭中或在群體中對其進行測量。“測序和比較單個精子細胞的基因使得直接且更為系統(tǒng)地探究了這一現(xiàn)象。”Auton說。
通過對單個精子細胞測序，研究人員正在解析重組率
因此，當中國強大的測序機構北京基因組研究所（Beijing Genomics Insititute）告訴Auton已經(jīng)完成了對一名50歲年紀亞洲男性的167個精子的測序時，Auton熱切地想要看到數(shù)據(jù)。他初期的分析突出了分離單細胞以及可靠地拷貝DNA進行測序是多么的困難。研究人員發(fā)現(xiàn)了若干來自多種細胞的DNA序列；然而只有40個達到了標準。通過將每個精子的DNA與來自血液樣本的DNA進行比較，Auton和他的同事們檢測到了近1000次重組事件，每個精子細胞約24.5次，這一數(shù)字與來自間接方法的預測相一致。重組在整個染色體不均衡發(fā)生，一些“熱點”（hot spot）代表了重組率增高位點。大多數(shù)情況下，Auton發(fā)現(xiàn)的熱點與研究人員在其他研究中看到的相一致。然而在15號染色體上也有一個重組波峰，Auton在會議上報告說。
來自斯坦福大學的Stephen Quake一直在利用一種所謂的芯片實驗室（lab on a chip）開發(fā)單細胞技術。樣本通過一連串微通道和微閥門分離單個細胞提取出DNA，并拷貝數(shù)千次以獲得足夠的量用于測序。Quake報告說他已經(jīng)解決了許多技術問題。他在去年完成了第一次的人類單細胞測序，現(xiàn)在他正利用這項技術研究精子細胞中的重組并分析突變率。
這一微流體設備分離了單個細胞并復制了它們的DNA
在單細胞研究的大潮中，新的測序方法層出不窮。不過，很少有人對這些方法進行系統(tǒng)的比對。慕尼黑大學生物學家Wolfgang Enard最近領導團隊，在小鼠胚胎干細胞的基因表達研究中比較了一些常用的單細胞測序方法，包括Smart-seq、CEL-seq、SCRB-seq和Drop-seq。
01-Smart-seq
SMART（Switching mechanism at 5’ end of the RNA transc ript）是一個具有里程碑意義的重要技術。實際上，能夠從單細胞生成全長cDNA的測序方案并不多，Smart-seq就是其中之一。對于等位基因特異性表達或者剪接變體研究來說，覆蓋整個轉(zhuǎn)錄組是一件非常重要的事情。
Fluidigm C1單細胞制備系統(tǒng)能夠自動完成Smart-seq步驟。你只需要將制備好的細胞懸液加進去，儀器就會分離并裂解細胞，把mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再對cDNA進行擴增。擴增后的cDNA可以拿來測序，也可以進行qPCR檢測。
在Enard的比較研究中，F(xiàn)luidigm C1系統(tǒng)的Smart-seq最為靈敏，成本也最高。這一系統(tǒng)使用的微流體芯片不能重復使用，不過這種芯片可以放到顯微鏡下觀察，證實健康單細胞的存在。
02-CEL-seq
CEL-seq（Cell ex pression by linear amplification and sequencing）是一種采用線性擴增的常用測序方法。線性擴增的主要優(yōu)勢是錯誤率比較低，不過線性擴增和PCR都存在序列依賴性偏好。
CEL-seq技術發(fā)表于2012年，主要是分離單細胞，逆轉(zhuǎn)錄帶有poly-A 尾巴的mRNA片段，給它們貼上代表其細胞來源的條碼。2014年Science雜志發(fā)布的MARS-seq與CEL-seq很類似。
CEL-seq和其他線性擴增方法生成文庫花費的時間要稍微長一點。不過，CEL-seq在早期階段就給樣本貼上條碼并進行混合，大大減少了手動操作的時間。PCR是在最后階段使用的，主要是為了連接正確的測序接頭，CEL-seq開發(fā)者紐約大學的Itai Yanai介紹到。
CEL-seq所需試劑都是現(xiàn)成的，大約兩天時間生成測序文庫和測序數(shù)據(jù)，Yanai指出。需要注意的是，CEL-seq與大多數(shù)方案一樣，測序轉(zhuǎn)錄本的3’端。Enard等人并沒有親自嘗試著一技術，只是在比較研究中用到了CEL-seq數(shù)據(jù)。從這項研究來看，CEL-seq的重現(xiàn)性最好。
GitHub網(wǎng)站提供有CEL-seq可用的生物信息學工具。Yanai研究團隊正在開發(fā)新版本CEL-seq2，新版本的靈敏度將比舊版本高三倍。
03-SCRB-seq
Broad研究所開發(fā)的SCRB-seq（single-cell RNA barcoding and sequencing）技術采用的是PCR擴增。該技術需要結(jié)合流式細胞儀（FACS）或者其他細胞分選方法，把單細胞分配到微孔里去。
SCRB-seq與Smart-seq比較相似，只不過SCRB-seq會整合特異性的細胞條碼，以分辨擴增分子的來源，更準確的定量轉(zhuǎn)錄本。此外，SCRB-seq并不生成全長cDNA，而是像CEL-seq一樣富集RNA 3’端。
2014年，開發(fā)者們將SCRB-seq技術提前發(fā)布在BioRXiv上。隨后他們對這一技術進行了更新，并將其更名為“high-throughput eukaryote 3’ digital gene ex pression”。Broad研究所仍提供有SCRB-seq技術服務，SCRB-seq也被整合到了Wafer GenBio systems公司的scRNA-seq平臺上。據(jù)說Fluidigm公司的C1系統(tǒng)很快也將支持SCRB-seq方案。SCRB-seq目前是Enard最中意的測序方法，它不僅適用于單細胞RNA測序，還能支持大量細胞（bulk）的RNA測序。可惜的是SCRB-seq并不好DIY，研究者自己很難將測序流程與FACS對接起來。
04-DROP-seq和inDROP
哈佛醫(yī)學院的研究人員開發(fā)了以微滴為基礎的兩種獨立技術Drop-seq和inDrop。他們利用微流體裝置將帶有條碼的微珠和細胞一起裝入微小的液滴，建立了快速、廉價、高通量的單細胞RNA-seq方法。這兩種技術將細胞隔離在微小的液滴中，裝上用于擴增的條碼引物，由此檢測數(shù)以千計的細胞。研究者們認為，Drop-seq和inDrop能夠幫助生物學家進一步發(fā)現(xiàn)和分類人體細胞，繪制大腦等復雜組織的細胞多樣性圖譜，更好地了解干細胞分化，獲得更多疾病的遺傳學信息。
Enard及其同事發(fā)現(xiàn)，Drop-seq在單個細胞中檢測的基因數(shù)還不到Smart-seq/C1、CEL-seq和SCRB-seq的一半。不過，在統(tǒng)計學水平上研究差異性表達的時候，高通量Drop-seq和SCRB-seq是最劃算的。哈佛醫(yī)學院Steve McCarroll實驗室去年下半年根據(jù)用戶反饋，在自己網(wǎng)站上公布了3.1版的Drop-seq（mccarrolllab.com/dropseq）。
參與開發(fā)SCRB-seq的Stefan Semrau正在搭建自己的Drop-seq平臺。Semrau從Whitehead生物醫(yī)學研究所搬到Leiden物理研究所的時候，發(fā)現(xiàn)自己用FACS已經(jīng)不那么方便了，于是他為新實驗室選擇了Drop-seq。建立微流體芯片和液滴系統(tǒng)是整個過程中最艱難的部分，不過Semrau實驗室的一名微流體博士后僅用三周就搞定了這些問題。Drop-seq文庫制備是任何分子生物學研究者都熟悉的標準操作。據(jù)Semrau估計，搭建和優(yōu)化Drop-seq大概只需要六個月時間。
05-scMT-seq
加州大學范國平教授和同濟大學薛志剛教授在5月5日的Genome Biology雜志上發(fā)布了自己開發(fā)的新測序方法——scMT-seq。這種方法能夠同時分析單個細胞的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組。
研究人員用這種方法對感覺神經(jīng)元進行研究，揭示了細胞間的轉(zhuǎn)錄組和甲基化組異質(zhì)性。不過，這些差異大多不是啟動子甲基化造成的。舉例來說，啟動子帶CpG島的基因，表達水平與基因體甲基化正相關。這項研究表明，scMT-seq可以用來檢測單細胞中的轉(zhuǎn)錄組、甲基化組和單核苷酸多態(tài)性信息，進而解析表觀遺傳學基因調(diào)控機制。
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